細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室-生物污染

更新時(shí)間：2022-07-26

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生物污染簡(jiǎn)介：

細(xì)胞培養(yǎng)物污染往往是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室常遇到的問題，有時(shí)會(huì)帶來(lái)十分嚴(yán)重的后果。

細(xì)胞培養(yǎng)污染物主要分為兩類。

一是化學(xué)污染物，例如：培養(yǎng)基、血清和水中的雜質(zhì)、內(nèi)毒素、增塑劑和去污劑，

二是生物污染物，例如：細(xì)菌、霉菌、酵母、病毒、支原體以及其他細(xì)胞系的交叉污染。盡管無(wú)法*消除污染，但是可以通過充分了解污染源以及采用良好的無(wú)菌技術(shù)，降低污染發(fā)生的頻率和嚴(yán)重程度。此部分將概括介紹主要的幾種生物污染。

細(xì)菌：

細(xì)菌是一大類廣泛存在的單細(xì)胞微生物。細(xì)菌直徑一般為幾個(gè)微米，外形多樣，例如：球狀、桿狀和螺旋狀。細(xì)菌由于分布廣泛、生長(zhǎng)迅速以及體積大小的特點(diǎn)，與酵母和霉菌一起構(gòu)成了細(xì)胞培養(yǎng)中常遇到的生污染物。培養(yǎng)物被細(xì)菌污染后，幾天內(nèi)即可通過簡(jiǎn)單的肉眼觀察發(fā)現(xiàn)；被感染的培養(yǎng)物通常呈云霧狀（即：渾濁狀），有時(shí)表面會(huì)覆蓋一層薄膜。另外，經(jīng)常還會(huì)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的pH值突然降低。在低倍顯微鏡下可見，細(xì)菌為細(xì) 胞之間移動(dòng)的微小顆粒，在高倍顯微鏡下觀察可以分辨出各個(gè)細(xì)菌的形狀。下列模擬圖像顯示了貼壁生長(zhǎng)的293細(xì)胞被大腸桿菌污染。

酵母：

酵母是真菌界的一種單細(xì)胞真核微生物，大小從數(shù)微米（多見）到40微米（罕見）不等。與細(xì)菌污染類似，培養(yǎng)物被酵母污染后也會(huì)變得渾濁，特別是進(jìn)入污染后期時(shí)。培養(yǎng)物 -被酵母污染后pH值變化極小，污染嚴(yán)重時(shí)pH值才會(huì)升高。在顯微鏡下，酵母呈單個(gè)卵圓形或球形顆粒，有些會(huì)芽生出較小的顆粒。下列模擬圖像顯示了貼壁生長(zhǎng)的293細(xì)胞接種24小時(shí)后被酵母感染。

霉菌：

霉菌是真菌界的一種真核微生物，以被稱為菌絲的多細(xì)胞絲狀體形式生長(zhǎng)。這些多細(xì)胞絲狀體構(gòu)成的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)含有遺傳性相同的細(xì)胞核，被稱為集落或者菌絲體。與酵母污染類似，霉菌污染初期培養(yǎng)物pH值會(huì)維持穩(wěn)定，污染加重后pH值會(huì)迅速升高，導(dǎo)致培養(yǎng)物渾濁。在顯微鏡下，菌絲體通常呈細(xì)束狀纖維，有時(shí)呈較為密集的抱子團(tuán)塊。許多種霉菌的抱子在休眠期均可耐受極-端嚴(yán)峻、不利的環(huán)境，當(dāng)其遇到合適的生長(zhǎng)條件時(shí)才會(huì) 被活化。

病毒：

病毒是一種微觀感染性物質(zhì)，利用宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行復(fù)制。病毒體積極小，因而要檢測(cè)培養(yǎng)物中有無(wú)病毒以及將其從細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室所用試劑中去除都十分困難。由于大多數(shù) 病毒對(duì)宿主有非常嚴(yán)格的要求，因此一般不會(huì)對(duì)與其宿主物種不同的細(xì)胞培養(yǎng)物造成不良影響。但是，使用病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)卻會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員造成嚴(yán)重的健康威脅，特別是當(dāng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的是人或靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞時(shí)。通過電子顯微鏡檢查、一組抗體的免疫染色、ELISA實(shí)驗(yàn)或者采用適當(dāng)病毒引物的PCR技術(shù)可以檢測(cè)出細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒污染。

支原體：

支原體是一種沒有細(xì)胞壁的簡(jiǎn)單細(xì)菌，被認(rèn)為是能夠自我復(fù)制的最小的生物。由于體積極小（一般小于1微米），支原體的檢測(cè)十分困難，除非其達(dá)到極-高的密度，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)物變質(zhì)，在此之前往往沒有明顯的感染征象。有些生長(zhǎng)緩慢的支原體可能會(huì)在培養(yǎng)物中持續(xù)存在，而不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但是這些支原體會(huì)改變培養(yǎng)體系中宿主細(xì)胞的行為和代謝。慢性支原體感染的可能表現(xiàn)包括：細(xì)胞增殖速度降低、飽和密度下降以及懸浮培養(yǎng)物凝集；但是，唯-一切實(shí)有效的檢測(cè)支原體污染的方法就是采用熒光染色、ELISA、PCR、免疫染色、放射自顯影或者微生物學(xué)測(cè)定技術(shù)定期檢測(cè)培養(yǎng)物。

交叉污染：

雖然不如微生物污染普遍，但是許多細(xì)胞系與HeLa細(xì)胞及其他生長(zhǎng)迅速的細(xì)胞系間廣泛的交叉污染是一個(gè)明確的問題，會(huì)造成嚴(yán)重的后果。從聲譽(yù)好的細(xì)胞庫(kù)獲取細(xì)胞系、定期檢查細(xì)胞系的性質(zhì)以及采用良好的無(wú)菌技術(shù)是有助于避免交叉污染的慣例方法。通過 DNA指紋圖譜、核型分析和同位素分析可以確認(rèn)細(xì)胞培養(yǎng)物有無(wú)交叉污染。

抗生素的使用：

細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)不應(yīng)常規(guī)使用抗生素，因?yàn)檫B續(xù)使用抗生素會(huì)促進(jìn)抗生素耐藥性細(xì)胞株的產(chǎn)生，導(dǎo)致輕度污染持續(xù)存在。一旦將抗生素從培養(yǎng)基中去除，這種輕度污染最終將發(fā)展成大規(guī)模污染，而且連續(xù)使用抗生素還會(huì)掩蓋支原體感染及其他隱性污染。另外，有些抗生素會(huì)與細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)，干擾您研究的細(xì)胞過程。

抗生素只能作為對(duì)付污染的最后手段而且只能短期使用，并應(yīng)盡快撤除。如果長(zhǎng)期使用抗生素，則應(yīng)同時(shí)進(jìn)行無(wú)抗生素培養(yǎng)，以便作為鑒別隱性感染的對(duì)照。