土壤幾丁質(zhì)酶（Soil Chitinase，S-Chitinase）試劑盒說明書

發(fā)布時間：2023/9/22

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微量法100T/48S

注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

幾丁質(zhì)主要存在于蝦、蟹、昆蟲等甲殼類動物的外殼與軟體動物的器官(例如烏賊的軟骨)，以及真菌類的細胞壁中，而幾丁質(zhì)酶(EC 3.2.1.14)可催化幾丁質(zhì)水解，具有抵御真菌侵染的作用，成為抗真菌病害的研究熱點。

測定原理：

幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生N-乙酰氨基葡萄糖，進一步與對二甲氨基苯甲醛產(chǎn)生紅色化合物，在585nm處有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了幾丁質(zhì)酶的活性。

自備實驗用品及儀器：

天平、水浴鍋、離心機、震蕩儀、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板，甲苯、蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體10mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體4mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體65mL×1瓶，4℃避光保存。

樣品處理：

新鮮土樣風(fēng)干，過30-50目篩。

測定操作表：

	對照管	測定管
土樣（g）	0.1	0.1
甲苯（μL）	15	15
混勻，25℃靜置15min
蒸餾水（μL）	100
試劑一（μL）		100
混勻，37℃培養(yǎng)24h
蒸餾水（μL）	200	200
4000rpm，4℃，離心10min，取上清200μL于新的EP管中
試劑二（μL）	20	20
混勻，沸水浴5min
試劑三（μL）	600	600
混勻，37℃顯色20min，取200μL于微量石英比色皿/96孔板中，蒸餾水調(diào)零，測定585nm處吸光值，記為A對照管和A測定管，ΔA=A測定管-A對照管。

計算公式：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線：y=5.2714x-0.0007，R2=0.9989；x為標準品濃度（mg/mL），y為吸光值ΔA。

酶活性定義：37℃條件下，每克土壤每天分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活性單位。

土壤幾丁質(zhì)酶活性（μg/d/g 土樣）=（ΔA +0.0007）÷5.2714×V反總÷W÷T×1000

= 598×（ΔA +0.0007）

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.315mL；W：樣本質(zhì)量，0.1g；T：反應(yīng)時間，1d；1000：1mg/mL=1000μg/mL

b. 用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y=2.6357x-0.0007，R2=0.9989；x為標準品濃度（μg/mL），y為吸光值ΔA。

酶活性定義：37℃條件下，每克土壤每天分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活性單位。

土壤幾丁質(zhì)酶活性（μg/d/g 土樣）=（ΔA +0.0007）÷2.6357×V反總÷W÷T×1000

= 1195×（ΔA +0.0007）

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.315mL；W：樣本質(zhì)量，0.1g；T：反應(yīng)時間，1d；1000：1mg/mL=1000μg/mL

注意事項：

試劑一充分混勻后再使用。