土壤羥胺還原酶（hydroxylamine reductase,HR）試劑盒說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間：2023/9/26

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微量法100T/48S

注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

土壤羥胺還原酶能將土壤中氮代謝過(guò)程中形成的中間產(chǎn)物羥胺還原為氨，土壤中的還原態(tài)化合物可作為氫的供體，其強(qiáng)弱影響到土壤氮代謝過(guò)程中氮素的氨揮發(fā)損失，間接影響氮肥的利用效率。

測(cè)定原理：

硫酸鐵銨中的Fe3+可將羥胺氧化為氮?dú)猓陨肀贿€原為Fe2+，F(xiàn)e2+在弱酸條件下與鄰菲羅琳形成橙紅色配合物，在510nm處有吸收峰，羥胺還原酶作用于羥胺，使配合物形成量減少，510nm處吸光值的減少可反映羥胺還原酶的活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、常溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、震蕩儀、氮吹儀。

試劑組成和配制：

試劑一：液體4mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加4mL蒸餾水充分溶解。

試劑三：液體12mL×1瓶，4℃保存。

試劑四：液體8mL×1瓶，4℃保存。

試劑五：液體4mL×1瓶，4℃保存。

試劑六：液體2mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑七：液體2mL×1瓶，4℃避光保存。

樣品處理：

新鮮土樣自然風(fēng)干或 37 度烘箱風(fēng)干，過(guò) 30~50 目篩。

測(cè)定操作表：

	空白管	對(duì)照管	測(cè)定管
風(fēng)干土樣（g）		0.02	0.02
試劑一（μL）	40		40
蒸餾水（μL）		40
試劑二（μL）	40	40	40
試劑三（μL）	120	120	120
混勻后，用N2氣流排除管中空氣，立即密封，于30℃反應(yīng)1h
試劑四（μL）	80	80	80
充分震蕩10min，8000rpm，25℃，離心10min
上清液（μL）	20	20	20
試劑五（μL）	40	40	40
試劑六（μL）	20	20	20
試劑七（μL）	20	20	20
蒸餾水（μL）	100	100	100
充分混勻，25℃靜置顯色10min，用蒸餾水調(diào)零，于微量石英比色皿/96孔板測(cè)定510nm各管吸光值，分別記為A空白管、A標(biāo)準(zhǔn)管、A對(duì)照管、A測(cè)定管，△A＝A空白管－（A測(cè)定管－A對(duì)照管）。

計(jì)算公式：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.185x -0.1828，R2 = 0.9992

酶活定義：每克土壤每天轉(zhuǎn)化1μg羥胺為一個(gè)酶活力單位。

HR活性（μg/d /g土樣）=（△A+ 0.1828）÷ 0.185×V反總÷W÷T

= 36.32×（△A+0.1828）÷W

b. 使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0925x -0.1828，R2 = 0.9992

酶活定義：每克土壤每天轉(zhuǎn)化1μg羥胺為一個(gè)酶活力單位。

HR活性（μg/d /g土樣）=（△A+ 0.1828）÷ 0.0925×V反總÷W÷T

=72.64×（△A+0.1828）÷W

V反總：加入提取液體積，0.28mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：1/24h

注意事項(xiàng)：

1. 土壤表層溶解氧濃度較大，取樣應(yīng)取表層5cm以下的土壤，否則酶活性較低或者測(cè)定不到。

2. 試劑三盡量不要敞口放置，取完立即加蓋擰緊。

3. 反應(yīng)體系最好能用氮吹儀排除溶解氧，若無(wú)此裝置，則加入試劑三后立即密封，于30℃反應(yīng)1h。