人皰疹病毒 8 型探針法熒光定量PCR試劑盒

產(chǎn)品名稱：人皰疹病毒 8 型探針法熒光定量PCR試劑盒

英文名稱：Human Herpesvirus-8(HHV-8) Probe qPCR Kit

人皰疹病毒 8 型（Human Herpesvirus-8，HHV-8) 會(huì)引起人類的原發(fā)和繼發(fā)感染，原發(fā)感染在兒童中多見，水痘的出疹突發(fā)，常出現(xiàn)紅色皮疹或斑疹，  繼續(xù)發(fā)展為成串水皰、膿皰，最后結(jié)痂。病情一般較輕，但偶可并發(fā)間質(zhì)性肺炎和感染后腦炎。該病毒對(duì)人體健康造成嚴(yán)重?fù)p害，因此快速檢測人皰疹病毒 8 型具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測人皰疹病毒 8 型的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3. 提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù)牛腺病毒（4-8 型）DNA 高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他微生物的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時(shí)線性范圍至少為 5 個(gè)數(shù)量級(jí)。

6. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。

7.本產(chǎn)品只能用于科研。

【試劑組成】

【自備試劑】樣品RNA。

【注意事項(xiàng)】

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本  產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對(duì)照。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2.       用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同。

3.       在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.       換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.       換槍頭，在 4 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.       重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.       如果有 N 個(gè)樣品待提取，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的是 PC（樣品制備陽

性對(duì)照）和 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以取陽性對(duì)照的 1000 倍稀釋液10μL 再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規(guī)定體積一致，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8.       用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA/提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.       如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.      在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)  置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好

后最后加）：

11.  蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：

四、數(shù)據(jù)處理

12.  如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品核酸濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13.  如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 41。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 39。對(duì)待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 41 則為陰性，如果小于或等于 39 則為陽性。如果在 39-41 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct值如果大于或等于 41 則為陰性，如果小于 41，則為陽性。